婴幼儿配方乳粉中甲醛含量测定及暴露污染评估

采用气相色谱定量及气相色谱-质谱确证,建立婴幼儿配方乳粉中甲醛含量的测定方法,并对网购45 份婴幼儿配方乳粉中甲醛的污染水平进行调查分析与暴露风险评估。通过优化前处理条件,考察方法的线性关系、精密度、准确度、检出限及定量限等指标,采用外标法定量。结果表明：该方法在0～10 μg范围内线性良好（r＞0.999）,方法检出限为0.1 mg/kg,定量限为0.3 mg/kg;0.3、0.6、3.0 mg/kg加标水平下的平均加标回收率为88.33%～96.56%,相对标准偏差小于10%;当冲调温度高于40 ℃,     

新型莫西菌素浇泼剂对羊蜱蝇和消化道线虫驱虫药效评价

试验旨在通过新型莫西菌素（moxidectin,MOX）浇泼剂对羊的驱虫试验,评价MOX浇泼剂对羊蜱蝇和消化道线虫的临床药效。将150只阿勒泰羊经产母羊随机分为6组,每组25只,分别为不用药对照组、螨净药浴组、MOX注射组和MOX低（0.05 mL/（kg·BW））、中（0.1 mL/（kg·BW））和高（0.2 mL/（kg·BW））剂量浇泼组,试验期为1周。试验第1天按前述分组中方法和剂量驱虫1次。观察受试动物临床表现,测定给药前1天和给药后第7天体温、脉搏和呼吸（TPR）,血液生理、生化和尿常规指标;测定羊蜱蝇减虫率、治愈率。采取粪样测定消化道线虫每克粪中虫卵个数（EPG）减少率及转阴率。结果显示,与不用药对照组相比,给药后第7天各驱虫组TPR、血液生理、生化及尿常规指标均无显著差异（P>0.05）。螨净药浴组羊蜱蝇减虫率为43.7%,而MOX注射组及MOX低、中、高剂量浇泼组均为100%。螨净药浴组治愈率为13.0%,而MOX注射组及MOX低、中、高剂量浇泼组均为100%;与不用药对照组相比,螨净药浴组消化道线虫卵减少率为0,而MOX注射组及MOX低、中、高剂量浇泼组分别为91.6%、93.1%、94.9%和97.8%。螨净药浴组虫卵转阴率为0,而MOX注射组及MOX低、中、高剂量浇泼组分别为77.0%、69.2%、69.2%和84.6%。本试验结果表明,新型MOX浇泼剂对体外寄生虫和消化道线虫均有显著疗效,且优于螨净药浴,与MOX注射剂等效。实践应用中最适MOX浇泼剂量推荐为0.05 mL/（kg·BW）（即0.25 mg/（kg·BW））。     

哈萨克羊iNOS基因多态性与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在探讨哈萨克羊诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因多态性与布鲁氏菌病的相关性。使用虎红平板凝集试验（RBPT）方法对231只哈萨克羊血清进行布鲁氏菌病血清学检测,参考GenBank中绵羊iNOS基因序列,针对其第6、7、8外显子及其邻近内含子片段设计引物,利用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对231只哈萨克羊的iNOS基因进行多态性检测,分析其SNPs与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。结果表明,67只哈萨克羊为布鲁氏菌感染阳性,阳性检出率为29.00%。在哈萨克羊iNOS基因的外显子6和8片段上未检测到多态位点,在外显子7片段上检测出F7-T18054C和F7-C18084T 2个多态位点,在F7-T18054C多态位点上检测到3种基因型（TC、TT、CC）,优势等位基因和基因型分别是C型和CT型,其等位基因频率和基因型频率分别是0.660和0.446。在F7-C18084T多态位点上检测到2种基因型（CT、CC）,优势等位基因频率和基因型分别是C和CC型,其等位基因和基因型频率分别是0.946和0.892。F7-C18084T属于低度多态（PIC<0.25）,F7-T18054C属于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。相关性分析表明,F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性无显著相关性（P>0.05）。试验结果表明,哈萨克羊iNOS基因F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性不存在相关性。     

1株奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为确定奶牛垫料中是否含有病原菌并深入了解垫料中优势生长菌的类型、耐药性及致病性等情况,本试验进行了细菌分离培养、革兰染色镜检、生化试验鉴定、16S rDNA序列分析及同源性比对、药敏试验、小鼠致病性试验。结果显示,分离菌在普通营养琼脂平板上形成圆形、表面光滑的白色菌落,血琼脂平板上形成黏稠、较大的白色菌落。革兰染色镜检结果显示,分离菌为革兰阳性,球型,呈葡萄串状排列,或单个散落。生化试验结果显示,分离菌对木糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、硝酸盐还原等呈阳性反应,而蜜二糖、木糖醇、山梨醇、尿素、V-P反应等呈阴性反应。16S rDNA序列分析结果显示,扩增的16S rDNA序列长度为1 298 bp,与松鼠葡萄球菌的核苷酸同源性达99.85%~100%;系统进化树结果显示,分离菌与松鼠葡萄球菌处于同一分支。动物试验结果表明,分离菌株对试验小鼠有较强的致病性,以0.2 mL/只（7.9×10⁸ CFU/mL）菌液的剂量接种小鼠,在48 h内死亡率为60%（3/5）。药敏特性分析结果显示,分离菌株对复方新诺明、氨苄西林等7种药物敏感,对克林霉素、头孢噻肟和头孢呋辛中度敏感,对青霉素、红霉素和林可霉素耐药。本研究为奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及防控提供了参考依据。     

气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

恩诺沙星与磺胺二甲嘧啶联合毒性探究

本研究旨在探究恩诺沙星与磺胺二甲嘧啶的联合毒性。选取SD大鼠为试验对象,将其分成6组,每组12只,分别为高剂量联合用药组（500 mg/kg体重）、中剂量联合用药组（250 mg/kg体重）、低剂量联合用药组（50 mg/kg体重）、恩诺沙星单药组（250 mg/kg体重）、磺胺二甲嘧啶单药组（250 mg/kg体重）及对照组（等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液）,配制相应的药物进行灌胃,最后一次给药1 d后对大鼠进行称重、麻醉、心脏采血并剖检取肝脏组织,然后对大鼠增重率、血常规指标、血清生化指标及肝脏病理学变化几个方面进行分析,并利用SPSS 22.0软件评估2种药物的联合作用效果。结果显示,在雌性大鼠中,高、中剂量联合用药组使大鼠增重率显著下降（P<0.05）,雄性大鼠增重率无显著变化（P>0.05）;雄性大鼠给药组白细胞数量均显著增加（P<0.05）,高剂量联合用药组中性粒细胞和淋巴细胞占比分别表现为显著升高及下降（P<0.05）;高、中剂量联合用药组大鼠外周血中谷草转氨酶含量显著增加（P<0.05）,且高、中剂量联合用药组肝脏病理切片视野可见不同程度的炎性细胞浸润,并伴有不同程度的损伤。本研究结果表明,恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶联用可使毒性增加,对大鼠的免疫系统状态有一定的影响,且能造成一定程度的肝脏损伤,剂量越高影响越大。本研究为恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶联合用药机制的研究提供数据支持,并为二者的临床应用提供参考,提示新的食品安全评估应考虑药物联合暴露带来的影响。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌感染小鼠脾脏转录组分析

试验旨在探索羊源D型多杀性巴氏杆菌入侵宿主脾脏组织中引发的免疫应答途径。首先利用羊源D型多杀性巴氏杆菌(HN01菌株)感染小鼠,建立羊源D型多杀性巴氏杆菌感染的动物模型;之后利用转录组测序技术获得感染小鼠与正常小鼠的脾脏转录组数据,并使用COG、KOG、eggNOG、GO、KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行功能注释与分析,同时对于显著富集到关键免疫通路的差异表达基因使用STRING软件和KEGG mapper进行蛋白互作分析,筛选出核心通路中起关键作用的基因;最后选取关键的10个基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。转录组分析结果显示,与正常组相比,感染组中筛选出3 380个差异表达基因(P<0.01,log₂|FoldChange|≥0.5),其中1 691个基因上调,1 689个下调。基因功能富集分析结果表明,感染组脾脏中的差异表达基因主要发挥信号转导的功能,其主要参与的生物途径包括细胞因子与细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路。蛋白互作分析筛选出约28个核心差异表达基因,结合实时荧光定量RT-PCR验证后,其中9个基因的表达结果与测序一致,分别是C3、Cd4、Cxcl13、Lck、Gnai1、Grap2、IL-6、Cxcr6及Serping1基因。本研究初步证明了脾脏在抵抗多杀性巴氏杆菌入侵中参与了一系列免疫应答反应,为进一步研究羊源D型多杀性巴氏杆菌与宿主之间相互作用的分子机制奠定理论基础。     

拷贝数变异在畜禽中的研究进展

拷贝数变异（copy number variation,CNV）具有多种形式的变异结构,在品种多样性、生物进化和疾病相关性等研究中起着重要作用,并具有片段长度大、覆盖范围广等特点。随着分子生物学的发展及DNA测序技术的日渐成熟,人们对遗传变异的研究不断向DNA分子水平深入,多态性标记在畜禽育种中已逐渐成为动物育种研究的趋势和主流。由于CNV对基因的调控和表达所造成的影响更为显著,因此,CNV在重要畜禽中的研究越来越多。目前,已检测出大量有关畜禽重要经济性状的基因序列变异,并有许多研究均表明CNV与动物的重要经济特征及疾病的发生有关。笔者主要通过参考国内外相关的研究报道,简述了CNV的相关研究背景、概念、突变机制,归纳总结了CNV对牛、羊、猪、鸡的经济性状、繁殖性状和疾病调控的影响,以期通过对这些重要畜禽的基因组学研究揭示其适应性遗传机理和表型性状差异的遗传基础,开发相应的分子遗传标记,为畜禽的标记辅助选育提供理论基础。     

水牛犊牛血浆外泌体的分离与鉴定

研究旨在从水牛犊牛血浆中分离外泌体,并对分离的外泌体进行分子生物学特征分析和鉴定。采用差速离心法分离3头水牛犊牛的血浆外泌体,并在透射电子显微镜下观察其形态,使用纳米粒度及Zeta电位仪对提取的外泌体进行粒径大小分析,应用Western blotting方法检测外泌体标记蛋白钙联蛋白（Calnexin）、肿瘤易感基因101（TSG101）、CD9、CD81在3头水牛犊牛血浆外泌体中的表达情况。结果显示,从水牛犊牛血浆中分离的外泌体形态多为圆形和椭圆形,直径在30~150 nm;Western blotting检测结果表明,在水牛血浆外泌体表面,特异性蛋白Calnexin、TSG101和CD81阳性表达,CD9不表达。本研究从形态学和分子生物学特征等方面证实研究获得的提取物为外泌体,由此说明,差速离心法可以成功分离提取水牛犊牛血浆中的外泌体,为水牛外泌体的后续研究提供了重要技术基础和参考。